基因编辑作用于DNA，RNA剪接决定编辑后的等位基因产生哪些转录本，以及这些转录本能否翻译出有功能的蛋白，功能缺失的程度最终由蛋白表达水平决定。很多小鼠“没表型”，根子往往不在 Cas9，可能是剪接出了问题。

 

 

RNA剪接的基本过程

 

小鼠蛋白编码基因多为断裂基因：外显子被内含子分隔，转录生成的初始转录本（pre-mRNA）需经剪接去除内含子，外显子连接为成熟mRNA。

 

 

Exon and Intron Definition Interactions

 

剪接体由U1、U2、U4/U6、U5 snRNP及辅助蛋白组成，主要识别以下位点：

两次转酯反应后，内含子以套索结构释放并被降解，相邻外显子连接。

 

可变剪接

 

同一pre-mRNA可通过不同剪接方式产生多个转录本：

 

外显子跳跃：缺失该外显子，蛋白缺失对应结构域。

 

内含子保留：通常引入提前终止密码子（PTC），转录本易被无义介导的mRNA降解（NMD）清除。

 

剪接位点偏移：外显子长度改变，可能导致移码或氨基酸序列改变。

 

互斥外显子：不同转录本保留不同外显子，蛋白功能可能不同。

 

因此，设计编辑方案前需核对目标基因的全部主要转录本，而不是只参照最长转录本（RefSeq canonical isoform）。

 

A summary of our current understanding of pre-mRNA splicing by the spliceosome

 

剪接对基因编辑小鼠的影响

 

1. 外显子删除后的读码框

 

全身敲除常用策略是删除一个或多个外显子。若缺失长度为3的倍数，且剩余外显子可正常拼接，可能产生保留部分功能的截短蛋白。

 

设计原则：

 

选择覆盖较大比例编码区的关键外显子。

 

确认缺失后发生移码，并在下游尽早出现终止密码子。

 

逐一检查各转录本，避免只在一个isoform上成立。

 

2. 靶向剪接位点可实现蛋白水平下调

 

将sgRNA置于外显子–内含子交界处的5′供体位点，indel会破坏GU保守序列，导致：

 

1.经典剪接失效；

 

2.剪接体启用隐秘位点，产生缺失或插入的转录本；

 

3.多数异常转录本携带PTC，经NMD降解；

 

4.蛋白表达下降。

 

这一策略可作为功能缺失程度介于杂合缺失与完全敲除之间的模型。需要注意：剪接位点编辑的等位基因不一定是“完全无效”，应以RT-PCR和Western结果判定。

 

3. 条件敲除中的剪接

 

常规flox方案将LoxP置于关键外显子两侧内含子，Cre介导外显子切除后发生移码失活。

 

插入位点需同时满足：

 

不破坏5′供体、分支点、多聚嘧啶tract及3′受体；

 

不干扰内含子调控元件和外显子剪接增强子（ESE）；

 

不导致未重组状态下的外显子跳跃或表达下降。

 

若flox纯合鼠在未诱导状态下已无蛋白表达，应优先排查LoxP插入引起的剪接改变，而非直接归因于“重组泄漏”。

 

4. 人工内含子型条件等位基因

 

该类设计在编码序列中插入一个可自我剪接的人工内含子：

 

DECAI/AIv4类系统已用于一步法条件等位基因构建；SCON为更短的同类盒，可通过ssODN供体在受精卵中一步敲入。

 

选型时应核查两项数据：未重组状态下的精确剪接效率，以及重组后的mRNA清除效率。前者决定基础表型是否干净，后者决定敲除是否彻底。

 

5. 小编辑引入的剪接改变

 

以下改动均可能改变剪接模式：

 

碱基编辑或点突变破坏经典GU/AG；

同义突变改变ESE或激活隐秘剪接位点；

 

小片段插入使外显子长度变为非3的倍数，或引入新的供体/受体二核苷酸；

 

同源供体臂或LoxP序列本身含有可被识别的剪接信号。

 

因此，同义突变不能默认“不改变功能”，donor序列在合成前应做剪接位点扫描。

 

总而言之，RNA剪接是真核细胞用剪接体把 pre-mRNA 里的内含子剪掉、外显子连起来的过程，靠“可变剪接”用有限的基因造出多样的蛋白质，是基因表达调控的核心环节之一。它既是全身KO、cKO和KI方案中必须控制的变量，也可被直接利用：剪接位点靶向用于降低蛋白表达，人工内含子用于构建条件等位基因，外显子跳跃报告鼠用于定量评价剪接干预。方案是否成立，取决于最终转录本组成与蛋白水平。

 

参考文献：

[1]Wilkinson ME, Charenton C, Nagai K. How is precursor messenger RNA spliced by the spliceosome? Annual Review of Biochemistry. 2020;89:359–388. doi:10.1146/annurev-biochem-013118-111024

[2]Rogalska ME, Vivori C, Valcárcel J. Regulation of pre-mRNA splicing: roles in physiology and disease, and therapeutic prospects. Nature Reviews Genetics. 2023;24:251–269. doi:10.1038/s41576-022-00556-8

[3]Ule J, Blencowe BJ. Alternative splicing regulatory networks: functions, mechanisms, and evolution. Molecular Cell. 2019;76:329–345. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.017

[4]Shenasa H, Bentley DL. Pre-mRNA splicing and its cotranscriptional connections. Trends in Genetics. 2023;39:672–685. doi:10.1016/j.tig.2023.04.008

 

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