他莫昔芬诱导的CreERT2/loxP系统是一种基于Cre重组酶和雌激素受体突变体（ER）的基因操作工具。该系统通过将Cre重组酶与一种特殊突变体的雌激素受体融合，形成CreERT2融合蛋白。这种突变的雌激素受体不再对体内自然产生的雌激素产生反应，而是能够特异性地识别并结合外源性药物他莫昔芬（Tamoxifen）。

 

仅仅使用Cre/loxP系统只能实现在特定空间的基因敲除或表达，而CreERT2/loxP系统在给予他莫昔芬后，精确地在特定时间点控制基因的敲除或报告基因的表达。这一技术对于研究胚胎致死基因在后期发育阶段的功能、进行细胞谱系追踪（Lineage Tracing）以及嵌合体分析（Mosaic Analysis）至关重要。

 

 

图 CreERT 系统的原理 图源北京大学实验动物中心

 

CreERT2系统的“泄露”

 

“泄露”指的是CreERT2系统在没有他莫昔芬诱导的情况下，仍然能够介导一定程度的基因重组。这种现象虽然在每个细胞中发生的程度可能不高，但在胚胎期、出生后发育期和成年期的多种组织中，却足以标记相当数量的细胞。这种非特异性的标记可能会严重影响谱系追踪和嵌合体分析实验的准确性，导致错误的研究结论。

 

例如，《Tamoxifen-independent recombination of reporter genes limits lineage tracing and mosaic analysis using CreERT2 lines》中，研究人员测试了三种不同的CreERT2工具鼠（Cdh5-CreERT2, Pdgfb-CreERT2, Prox1-CreERT2），结果发现所有这些品系在未给予他莫昔芬的对照组中，均观察到了报告基因的激活。这表明CreERT2系统将Cre酶完全隔离在细胞质中的能力并非100%有效，仍存在随机进入细胞核并发生重组的“泄露”现象。

 

 

图源Tamoxifen-independent recombination of reporter genes limits lineage tracing and mosaic analysis using CreERT2 lines

 

此外，“泄露”活性可能导致泄露细胞发生癌化，进而影响小鼠的健康。尤其是当小鼠周龄较大时，积累的泄露细胞数量增多，健康风险也随之增加。因此，为了减少这种风险，建议在小鼠周龄较小的时候进行实验，如果要进行繁育，最好是在6-8周龄时就开始配繁。

 

不同报告基因对基底活性的敏感性差异

 

报告基因的敏感性会影响CreERT2系统的实验结果。研究人员比较了四种常用的报告基因（Ai14, Ai3, mTmG, R26R-EYFP）在相同基底Cre活性下的重组效率。高敏感性报告基因如Ai14（tdTomato）和Ai3（EYFP）非常容易被低水平的基底Cre活性激活。而低敏感性报告基因如mTmG（EGFP）和R26R-EYFP（EYFP）则很难被基底活性激活。这种差异可能与loxP位点之间的距离有关，Ai14和Ai3的loxP位点距离较近，易于重组；而mTmG和R26R-EYFP的loxP位点距离较远，重组阈值更高。

 

 

图源Tamoxifen-independent recombination of reporter genes limits lineage tracing and mosaic analysis using CreERT2 lines

 

基底活性对谱系追踪实验的潜在干扰

 

CreERT2系统的基底活性还可能对谱系追踪实验产生干扰。例如，在携带 Cdh5(PAC)-CreERT2（内皮细胞特异性）和 Ai14报告基因的小鼠大脑中，除了内皮细胞，还发现了一些被标记的小胶质细胞。已知Cdh5不在成熟小胶质细胞中表达，这暗示这些细胞可能是在发育早期（当其祖细胞短暂表达Cdh5时）被基底Cre活性标记的。如果没有设置严格的未诱导对照组，这一结果可能被错误地解释为内皮细胞向小胶质细胞的转分化。

 

 

图源Tamoxifen-independent recombination of reporter genes limits lineage tracing and mosaic analysis using CreERT2 lines

 

细胞追踪实验设计建议：

 

在进行精细的细胞追踪实验时，必须认识到CreERT2系统的基底活性以及不同报告基因的敏感性差异。

 

1.强制性设置对照组：所有使用CreERT2系统的实验都必须包含未给予他莫昔芬的对照组（基因型为CreERT2/+; Reporter/+），以评估基底活性的水平。

 

2.谨慎选择报告基因：根据实验目的选择合适的报告基因。

 

对于谱系追踪、嵌合体分析等要求高精准度的实验，应优先选择高重组阈值的报告基因，如 mTmG 或 R26R-EYFP，以最大程度减少背景标记。

 

对于需要明亮荧光信号进行活细胞成像的实验，Ai14（tdTomato） 因其亮度和光稳定性仍是较好选择，但必须意识到其易泄漏的缺点，并合理解读结果。

 

3.验证实验结果：在进行嵌合体分析时，报告基因的表达应与基因敲除效果紧密关联，最好通过免疫组化或其他方法验证目标蛋白的缺失。

 

明迅生物动物中心

 

明迅实验动物研究中心采用屏障加IVC的运营方式，屏障区域设置检疫室、洁净物品接收室、洁净物品暂存室、手术室、3个独立的饲养室；检疫室、手术室、3个饲养室均配置了超净工作台，确保无菌操作的条件；在生物安全控制方面；人员准入、物品准入、和带动物操作、设施设备管理，预警机制均生效了相关操作规程，并进行了培训和严格的考核；多数不可高压的物品采用送专门辐照公司进行辐照灭菌消毒。制定了年度动物质量监测计划，明确了动物准入的条件要求。明迅生物环控严格，证件齐全，已获得以下证书：SPF级实验动物生产许可证、ISO质量管理体系认证，并于2025年10月正式获批AAALAC完全认证。

 

参考资料：

[1]https://mp.weixin.qq.com/s/v8Aqsjs9dwPEUt11BCktPA

[2]Álvarez-Aznar, A., Martínez-Corral, I., Daubel, N., Betsholtz, C., Mákinen, T., & Gaengel, K. (2019). Tamoxifen-independent recombination of reporter genes limits lineage tracing and mosaic analysis using CreERT2 lines. Transgenic Research. https://doi.org/10.1007/s11248-019-00177-8
 

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